EPI300電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86050-01(5×50ul)/BFNC86050-02(20×50ul)

EPI300 Electroporation-Competent Cell                50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（6個(gè)月）

基因型

F – mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara,leu)7697 galU galK λ – rpsL nupG trfA dhfr.

產(chǎn)品說明

EPI300電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。EPI300細(xì)胞含有一個(gè)突變的trfA基因，該基因表達(dá)出的蛋白產(chǎn)物可以促進(jìn)含有ori V復(fù)制子的質(zhì)粒的高拷貝擴(kuò)繁，誘導(dǎo)劑Ⅰ可以誘導(dǎo)trfA基因的表達(dá)。當(dāng)含有ori V復(fù)制子質(zhì)粒的EPI300細(xì)胞在LB/2YT或SOB培養(yǎng)基中生長時(shí)，trfA基因的表達(dá)被抑制，ori V復(fù)制子質(zhì)粒的拷貝數(shù)維持在很低的水平；當(dāng)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑Ⅰ，ori V復(fù)制子質(zhì)粒的拷貝數(shù)可維持在很高的水平，提高了質(zhì)粒產(chǎn)量。因此EPI300菌株可以降低ori V復(fù)制子質(zhì)粒的拷貝數(shù)，特別適合于各種不穩(wěn)定 DNA 或毒性基因的克隆。 [mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI300菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（例如：哺乳動(dòng)物基因組DNA）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。lacZΔM15 標(biāo)記的存在使EPI300可用于藍(lán)白斑篩選，rpsL賦予其鏈霉素抗性。此外，EPI300電擊感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率*，特別適用于文庫構(gòu)建。

青旗生物生產(chǎn)的EPI300電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>2×10¹⁰ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的EPI300電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手bo打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

   A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19；

   B. 對(duì)于連接產(chǎn)物，大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與EPI300電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無需進(jìn)行DNA純化，但DNA濃度不能過高，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。

   C. 對(duì)鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，然后與EPI300電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè)）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時(shí)。

EPI300電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

S.O.C 培養(yǎng)基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl₂

10 mM MgSO₄

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

注意事項(xiàng)

1. 加入DNA時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

2. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

3. 當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒或想獲得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

6. 對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，部分公司的連接體系或重組體系(例如：Thermo，NEB公司的T4 連接酶系統(tǒng)，NEB，天根的50度反應(yīng)重組系統(tǒng))可以直接與EPI300電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無需純化，但DNA濃度不能過高，盡量不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

7. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。

8. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞盡量保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。